绝对定量微生物组

1.绝对定量宏基因组能同时检测细菌、病毒与真菌吗？
答：细菌绝对定量采用的是16S qPCR法，真菌绝对定量采用的是ITS qPCR法，病毒绝对定量采用的是内参法或计数法（荧光或纳米孔）。因此，绝对定量宏基因组检测方法只能检测细菌、古菌和真菌。基因帮绝对定量宏基因组标准产品默认检测细菌和古菌。如果需要检测真菌，需选择包含真菌的个性化产品。如果需要检测病毒，需要选择绝对定量病毒组产品。

2.做绝对定量样本有什么特殊要求？
答：首先样本需要能被称量，即可以称重或者测量体积，准确记录样本采集时的体积（如血液 1mL、水体 500mL）或重量（如粪便 0.2g、土壤 1g），作为后续 “绝对浓度换算” 的基础（如最终结果需表示为 “拷贝数 / 克样本” 或 “拷贝数 / 毫升样本”）。其它要求和常规宏基因组是一样的。如需进行烘干处理，则需要提供常规宏基因组2倍以上的样品量。

3.固体样本需要做烘干处理吗？
答：含水率固定的样本可以不做烘干处理，统一以湿重作为计算标准，即绝对数量是以湿重为单位来计算。

根据研究需求（研究水分含量差异显著的不同样本，如健康粪便水分约 70%-80%，便秘粪便可能低至 50%；农田土壤水分 10%-30%，湿地土壤可达 40%-60%），也可以进行烘干处理，采用干重作为计算标准，即绝对数量是以干重为单位来计算。

4.采用核酸保护剂的粪便和土壤样本，如何做绝对定量？
答：处理方法上与常规有一定差异，需要同时取一份样本出来做烘干处理，测量干重，最后计算绝对数量是以干重为标准进行计算的。

5.需要做烘干处理的样本，送样量与不做烘干处理的有什么差异？
答：烘干处理需要额外样本处理，建议送两份样本，如果没有条件分装，以常规送样量的2-4倍为标准进行送样。

6.qPCR法与内参法的差异是什么？
答：两种方法的核心差异在于：内参法需向样本中掺入外源合成序列，这可能挤占样本中天然微生物的检测空间，干扰原始群落组成与定量准确性。尤其对于低微生物量样本（如低生物量环境样本或宿主占比极高的组织样本），过量外源序列的引入可能导致本就稀少的天然微生物序列被掩盖，甚至无法有效检出。  

相比之下，qPCR法则完美规避了这一问题：它无需向样本中添加任何外源物质，不会干扰原始微生物群落的组成结构，可直接通过特异性扩增目标基因（如16S rRNA基因）精准计数样本中的总微生物数量，尤其适用于对低丰度微生物的定量分析，结果更贴近样本的真实生物学状态。 

7.qPCR法最大的难点在哪里？
答：qPCR法的核心难点在于环境微生物污染对结果的干扰，尤其是空白对照的处理。在常规实验环境中，实验耗材、试剂乃至空气中普遍存在微量微生物，这直接导致qPCR检测时空白样本常出现非特异性扩增峰，部分空白对照的CT值甚至低于30，严重干扰定量准确性。  

基因帮的核心优势在于：依托病毒组P2实验室的严苛洁净标准（如负压环境、无菌操作流程），搭配低微生物负载的试剂组合，再结合样系列的特殊技术优化，最终实现空白对照样本零扩增信号（无出峰），从根本上消除了背景微生物污染对实验结果的干扰。

8.绝对定量宏基因组可以定量到什么水平？
答：通常可实现种水平和属水平的精准定量。这一结果的可靠性源于核心原理：绝对定量的分辨率直接取决于宏基因组测序的注释精度 —— 测序技术能够稳定注释到的分类水平（如种、属）。

9.是否可以做细菌负染电镜？
答：细菌负染电镜单独项目不接，做噬菌体项目可以顺带接，细菌送样要求如下：
每个样品准备两管：尽量让细菌自然沉淀， 去除上清时尽量操作轻柔，去除上清之后，下面沉淀的细菌浓度就比较高。1：轻轻吸取大概100-200ul到EP管里，4℃保存；2：轻轻吸取大概100ul-200到EP管里，体积比1:1加入2.5%戊二醛固定液，然后4度保存。分别标记下哪管是鲜样哪管是固定过的。如果细菌有生物危害，就只取固定的那一管；没有生物危害，就取2管